铝吸附疫苗产品稳定性研究与方法

铝化合物作为人用疫苗佐剂已有75年以上的历史，是人用和兽用疫苗中使用最广泛的佐剂。数十亿剂含铝盐的疫苗已安全地用于全球不同的人群。尽管它们被广泛使用，但关于这些产品的作用机制和稳定性研究的监管指南或者已发表的文献很少。尽管在治疗性蛋白化学和物理稳定性方面的知识取得了很大进展，但很少有已发表的将生物分析稳定性方法应用于蛋白质吸附到铝佐剂上的例子。本文介绍了铝吸附疫苗，并讨论了抗原稳定性的研究。

　　铝吸附疫苗

　　早期的疫苗佐剂使用的是明矾沉淀物制备的，这可能是异质的。之后，预先形成的氢氧化铝凝胶和后来的磷酸铝取代了明矾沉淀，并产生了铝吸附疫苗的标准化配方。随着重组表达蛋白抗原的鉴定，铝基佐剂继续用于新疫苗制剂中，可以作为灭活或减毒病原体的更安全替代品。此外，含有将铝与合成和天然配体连接起来的组合佐剂的疫苗已获批准。通常需要添加佐剂来诱导免疫反应和对可能不具有强免疫原性的蛋白质抗原进行有效的免疫。然而，铝佐剂的作用方式，我们还没有完全理解。潜在的机制包括铝在注射部位形成一个局部的高浓度范围，抗原从中缓慢释放;吸附疫苗的颗粒形式导致巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞摄取;并且直接刺激免疫系统。此外，有人提出蛋白质在铝凝胶上的吸附会导致结构不稳定，从而增加蛋白质的免疫原性。

　　人用疫苗中常用的铝盐制剂有两种：氢氧化铝(Alhydrogel)和磷酸铝(Adju-Phos)。铝佐剂的净表面电荷为零时的pH值称为零电荷点(point of zero charge，PZC)，类似于蛋白质的等电点(pI)。当溶液pH值低于PZC时，佐剂表面带正电，当溶液pH值大于PZC时，佐剂表面带负电。氢氧化铝的PZC约为11，磷酸铝的PZC为4-5.5，但应考虑疫苗制剂中使用的缓冲液，因为表面的离子置换可能会降低PZC并影响对抗原的吸附。对于许多蛋白质，抗原吸附在蛋白质抗原的pI和铝佐剂的PZC之间的pH内最好，因为在此pH范围内，蛋白质抗原和佐剂具有相反的电荷。因此，溶菌酶的pI为11.35，已被用作磷酸铝研究中的模型抗原。牛血清白蛋白(pI为4.7)和卵清蛋白(pI为4.5)更有效地与氢氧化铝结合。通常，Alhydrogel比Adju-Phos 具有更高的吸附能力，并且Alhydrogel的吸附能力随着其粒径的增加和蛋白质分子量的增加而降低。已被用作磷酸铝研究中的模型抗原。牛血清白蛋白(pI为4.7)和卵清蛋白(pI为4.5)更有效地与氢氧化铝结合。蛋白质对铝佐剂的吸附机制尚不完全清楚，可能是物理现象的组合，包括“静电引力、氢键、非极性相互作用、配体交换和范德华力”。对模型蛋白的研究发现静电相互作用是溶菌酶、人类生长激素、白喉类毒素、单克隆抗体和聚乙二醇化生长激素的主要吸附机制，但对于卵清蛋白，吸附涉及配体交换。氢氧化铝吸附HBsAg的主要机制被确定为HBsAg中的磷脂与氢氧化铝佐剂中的表面羟基之间的配体交换。当磷酸盐缓冲液的浓度增加时，HBsAG与硫酸羟基磷酸铝佐剂结合得更紧密。吸附强度与疫苗有效性的相关性与吸附机制有关。通过配体交换吸附的磷酸化蛋白质在高吸附强度与较差的抗原呈递和免疫反应之间具有反比关系。对三价肺炎球菌蛋白疫苗的研究表明，佐剂的选择会影响免疫原性，从而导致免疫原性的差异，并发现抗原表面微环境pH值较低和吸附强度降低可改善抗原稳定性。吸附强度与疫苗有效性的相关性与吸附机制有关。通过配体交换吸附的磷酸化蛋白质在高吸附强度与较差的抗原呈递和免疫反应之间具有反比关系。

　　吸附后抗原稳定性

　　疫苗制剂开发的一个重大挑战是了解吸附后的抗原稳定性。虽然铝沉淀和铝吸附疫苗已经使用了75年，但只有在过去15年中才报道了研究吸附对蛋白质结构和稳定性影响的研究，是因为开发了表征重组体的新技术被应用于疫苗研究。科学家描述了佐剂表面的蛋白质环境与溶液中的环境有何不同，这可能会导致结构变化。具体来说，对吸附在氢氧化铝上的1-磷酸葡萄糖(G1P)的酸催化水解速率的研究得出结论，佐剂表面微环境的pH值比本体溶液的pH值高约两个pH单位。佐剂表面极性和电荷密度的差异也可能导致结合蛋白结构的变化。

　　光谱方法已应用于研究由吸附引起的蛋白质结构扰动。包括荧光光谱、透射傅里叶变换红外 (FTIR)光谱、使用衰减全反射(ATR)池的FTIR光谱，以及圆二色性(CD)。差示扫描量热法(DSC)也已被应用。在模型疫苗的研究中，通过FTIR-ATR、荧光光谱技术和DSC通过吸附观察到结构变化。使用透射FTIR的研究得出结论，在六种模型蛋白质的研究中，吸附没有导致结构变化。总体而言，研究表明缓冲液浓度的变化，缓冲液pH值和抗原本身的特性可能会影响吸附的蛋白质抗原的结构。在乙型肝炎疫苗的研究中，抗原和氢氧化铝佐剂之间的相互作用通过优化磷酸根离子浓度而改变，并可能确保维持抗原的天然浓度。虽然没有提供结构信息，但得出了结论，含有40mM磷酸盐的制剂通过以下方式提高了热稳定性。通过优化磷酸根离子浓度来改变抗原和氢氧化铝佐剂之间的相互作用，并确保维持抗原的天然浓度。此外，FTIR-ATR研究确定结构变化取决于吸附的蛋白质量，在具有最大吸附量的样品中观察到更多的蛋白质。我们推测，在较低的吸附浓度下，会形成一个单分子层，其中吸附蛋白质受佐剂表面性质的影响，并且更加具有可变性。在更高的吸附水平下，蛋白质的连接更弱，可能会保留天然结构，虽然铝吸收疫苗特性研究的重点是蛋白质抗原结构。

　　疫苗稳定性研究的监管指南

　　关于铝吸附疫苗的作用机制和稳定性测试方法几乎没有一般性指导文件。FDA文件《疫苗或相关产品的工业指南、化学、制造和控制信息的内容和格式以及企业描述信息》指出，药物产品发布规范中应包括特性、纯度和效力，但不提供具体的测试方法或指导。美国药典(USP)第<1235>章人用疫苗——一般注意事项没有提供超出效力、一般安全性、无菌性、纯度、特性和成分材料测试的一般要求的释放和稳定性测试的具体建议。目前，只有一部铝吸附疫苗 USP专着(Anthrax Vaccine Adsorbed)，但在2018年8月被删停用。该指导包括对不含铝的无菌滤液进行的测试。对无菌滤液进行的测试包括蛋白质印迹鉴定、根据USP<1057>使用Bradford测定法检测总蛋白和使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白质。成品测试包括在体内相对效价、原子吸收光谱法测定铝浓度、安全性、无菌性、pH值、离子选择性探针测定氯化钠、滴定法测定苄索氯铵，以及使用紫外-可见光谱法测定甲醛的限度测试。

　　虽然没有关于包含效力指示的测试方法的具体指导，但可以从国际协调委员会(ICH)Q5E可比性的生物技术/生物制品的可比性中得出一些相似之处。在他们的制造过程中，该指南指出，“制造商应考虑生物测定的局限性，例如高变异性，这可能会阻止检测由于制造过程变化而发生的差异。”然而，也指出，“在生物测定还作为物理化学分析的补充(例如，作为高阶结构的替代测定)的情况下，使用具有适当精密度和准确度的相关生物测定可能会提供合适的确认特定高阶结构在制造过程更改后没有发生变化的方法。”虽然此分析的目的是评估稳定性而不是制造变化，但该指南可以外推到稳定性测试方法。

　　测试方法

　　理想情况下，为吸附的疫苗产品提供稳定性数据的测试方法不需要大量的样品制备或从佐剂中解吸抗原。有多种不同的适用于解吸的机制，但都有共同的缺点。解吸过程本身可能导致蛋白质抗原中的结构变化或额外的修饰或杂质。对于大多数测试方法中的分析，解吸的样品需要进行缓冲液交换步骤，这将导致溶液浓度未知，在通过稳定性指示方法进行分析之前，必须使用单独的分析来确定该浓度。最后，解吸回收率可能会有所不同，样品的回收率可能会降低。

　　根据其定义，未结合抗原的测量是在未解吸的成品(finished drug product，FDP)上进行的。该测试方法的目的是测量未从铝佐剂吸附或已解吸的游离蛋白质的量。通过离心制备样品，并除去上清液进行分析。通常，色谱法用于根据相同蛋白质的标准曲线来量化样品中游离蛋白质的量。色谱方法各不相同，可能包括尺寸排阻色谱(SEC)或反相高效液相色谱(RP-HPLC)。典型的方法可以基于用于分析抗原原料药(bulk drug substance，BDS)的方法，然后针对灵敏度进行优化并使用低水平标准曲线进行验证。

　　一些免疫学测试方法在Alhydrogel或磷酸铝存在的情况下是可行的，可用于鉴定，或在某些情况下，无需解吸即可进行定量。虽然蛋白质印迹不是一种实用的替代方法，因为SDS-PAGE不能在FDP上进行，但狭缝印迹和点印迹消除了分离步骤。在狭缝印迹或斑点印迹法中，产品直接施加到膜上，并可以使用微滤装置和真空将其拉过膜。可以根据需要进行额外的冲洗，以确保没有表面残留物留在膜上。在将样品、标准品和对照应用于膜后，将膜从装置中取出并使用标准程序进行免疫印迹。虽然没有确定公开的程序描述使用点或狭缝印迹分析铝吸附疫苗，但该技术用于定量流感疫苗中的血凝素和神经氨酸酶的分析。点和狭缝印迹的一个优点是可以同时分析多个样本，并且可以将膜切成条状以使用多种抗体进行免疫印迹，从而可以同时识别多种抗原。有文献也证明了直接铝凝胶制剂免疫测定(DAFIA)用于确定抗原身份和含量的可行性。在该方法中，将FDP添加到黑色多滴定板的孔中。离心和洗涤后，封闭孔，然后用一抗探测，然后用荧光素标记的二抗探测。

　　可以使用电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)直接测定铝佐剂的浓度。传统的蛋白质定量方法，例如UV-Vis光谱或RP-HPLC不适用于结合抗原。USP方法6<1057>利用邻苯二甲醛(OPA)已应用于铝水凝胶疫苗。OPA与N端胺基或赖氨酸侧链上的胺基反应，并在340nm/455nm处产生荧光信号。FDP的蛋白质浓度与标准曲线进行比较。OPA方法应用于含有Alhydrogel的疟疾候选疫苗，并确定为获得准确结果，Alhydrogel 必须以与样品相同的浓度包含在标准中。准确度为87-100%，线性范围为25-400μg/mL。在内部研究中，该方法使用非线性曲线拟合的范围为20-250μg/mL，结果准确度为98-110%，样品重复性≤2%(参见下图1中的代表性标准曲线)。

　　图1.模型疫苗的邻苯二甲醛(OPA)标准曲线。

　　有人也提倡将生物制药开发中常见的制剂前研究应用于含铝佐剂的疫苗。除了表征佐剂和游离抗原外，还建议评估抗原-佐剂配方，以了解吸附强度以及蛋白质抗原的结构和化学稳定性。

　　HPLC不适合分析完整的铝吸附FDP，因为疫苗分子会被柱筛板过滤，或者如果它们确实进入柱子，会导致柱堵塞和背压增加。RP-HPLC已应用于浓度测量，并在一定程度上用于解吸后疫苗的化学稳定性。虽然对完整抗原进行色谱分析需要进行解吸步骤，但肽图分析提供了一种强大的工具来验证FDP的身份以及评估吸附后和稳定性期间抗原的化学稳定性。在肽谱分析中，蛋白质被酶(如LysC或胰蛋白酶)消化以产生一组肽。所得的肽混合物可以通过色谱法分离，并与对照或BDS进行比较，或者可以通过质谱法进行分析，并与基于一级序列的肽的预期质量进行比较。还可以使用带飞行时间检测(MALDI-TOF)的基质辅助激光解吸质谱法分析肽混合物，而无需进行分离。Lys C消化解吸抗原，然后对含有Alhydrogel的三价肉毒杆菌疫苗进行MALD-TOF分析，检测到所有三种蛋白质抗原的氧化和脱酰胺反应，并且在佐剂存在下反应速率加快。最初使用250mM琥珀酸盐缓冲液(pH3.5)解吸样品，但在孵育后，解吸变得更加困难，因此需要使用4M尿素pH7.5缓冲液。解吸本身使分析复杂化，因为首先，它可能无法完全重现，特别是对于稳定性样品，其次，它可能导致额外的降解。在未发表的研究中，胰蛋白酶用于成功消化与Alhydrogel结合的抗原而不会解吸。在pH8.0的Tris/HCL缓冲液中，在37℃下孵育4小时的标准消化程序，然后是使用ACN/TFA流动相和C18柱的RP-HPLC。色谱图(参见下图2)消化后的FDP与消化后的BDS紧密匹配，表明非解吸肽图是评估FDP中抗原稳定性的可行方法。随着高质量准确度/高分辨率质谱仪的可用性不断提高，肽图分析已演变为多属性方法(multi-attributemethod，MAM)，它可以替代治疗性蛋白质的多种电泳和色谱稳定性指示方法。MAM在铝吸附疫苗中的应用有机会进一步了解蛋白质抗原稳定性并改进分析以支持质量源于设计(QbD)的开发以及质量控制(QC)的批放行。

　　图2.未消化的BDS(蓝色)、消化的BDS(红色)、消化的成品(FDP)(绿色)、BDS空白(粉色)、FDP空白(蓝色)和胰蛋白酶空白(紫色)的UV220nm色谱图。

　　MAM有可能取代在分析前都需要解吸的电泳和色谱稳定性指示方法。解吸方法从使用磷酸盐缓冲液pH7.4、磷酸盐缓冲液和Zwittergent、250mM琥珀酸盐缓冲液pH3.5到更苛刻的条件，例如20mM十二烷基硫酸钠(SDS)或20mM氯化十六烷基吡啶柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液和高达4M的尿素。多位研究人员指出，稳定性样品的解吸更具挑战性。因此，稳定性指示方法的解吸程序的开发应尽可能使用稳定性样品进行。解吸方法的选择将根据所使用的佐剂以及预期的分析方法和与解吸溶液的兼容性而有所不同。例如，在实验中使用SDS的方法(例如 SDS-PAGE或CE-PAGE)制备样品时，SDS将是解吸缓冲液的不错选择。此外，SDS不会显着干扰RP-HPLC。尿素通常用于毛细管电泳(ICE)成像程序的样品制备，并且是制备用于电荷分离方法(如ICE和离子交换色谱(IEX))的样品的首选缓冲液。使用SDS进行解吸的标准方案包括以下步骤：尿素通常用于毛细管电泳(ICE)成像程序的样品制备，并且是制备用于电荷分离方法(如ICE和离子交换色谱(IEX))的样品的首选缓冲液。使用SDS进行解吸的标准方案包括以下步骤：

　　混合缓冲液、SDS和疫苗FDP，并在70℃下孵育10分钟。

　　离心，去除上清液，并使用RP-HPLC测定蛋白质浓度。确保参考标准中的SDS浓度与样品中的浓度相匹配。

　　使用超滤过滤器浓缩并用水洗涤脱盐。在分析前利用体积确定近似浓度。

　　尿素解吸的标准步骤遵循类似的程序：

　　混合缓冲液、尿素和疫苗FDP，并在冷藏条件下摇晃18小时。

　　离心，去除上清液，并使用RP-HPLC测定蛋白质浓度。确保参考标准品中的尿素浓度与样品中的尿素浓度相匹配。

　　透析样品以降低尿素浓度。

　　重复RP-HPLC分析以确定浓度，使用超滤过滤器浓缩并用水洗涤脱盐。

　　执行ICE或IEX分析。

　　解吸后，可以使用标准程序和商业凝胶和试剂进行SDS-PAGE。如下图3所示的模型疫苗的分析使用预制凝胶(Thermo Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris)和推荐的样品和运行缓冲液(NuPAGE LDS样品缓冲液和NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液)。凝胶已在 37℃下储存0至5天的SDS解吸模型疫苗样品的分析结果。上样前将样品还原并使用考马斯蓝染色剂(NuPAGE胶体蓝染色试剂盒)染色。通过光密度测定法(Bio-Rad GS-800密度计和Quantity One软件)分析凝胶是否存在由于降解以及纯度百分比导致的额外条带。主条带的纯度范围从第0天样品的96%到第4天和第5天的90-91%，因此证明解吸SDS-PAGE方法具有稳定性指示。

　　图3.用于热处理样品的模型疫苗十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶。MW=分子量标记，RS=标准，C=对照样品，T0-T5=37℃下储存的天数，B=空白，S=灵敏度标准。

　　模型BSA-Alhydrogel疫苗的ICE分析是使用成像毛细管电泳系统进行的，检测波长为280nm(ICE280和ICE3系统，ProteinSimple)。如前所述，使用尿素解吸和透析制备样品，然后使用超滤过滤器浓缩。样品、参考物质和对照样品在稀释剂中稀释，稀释剂由缓冲液4-6.5、缓冲液液3-10、1g/mL尿素、0.7%甲基纤维素和pI标记物5.12和6.61组成。使用酸性阳极电解液(0.1%甲基纤维素，0.08M H3PO4)、碱性阴极电解液(0.1%甲基纤维素，0.10M NaOH)进行分析，并在3000V下分离10分钟。分析所得电泳图(ChromPerfect 7软件)的同种型纯度。模型疫苗样品在分析前在37℃下储存0至5天。下图4的电泳图叠加显示了每个样品的异构体分布。在非降解样品中，在pI6.1和6.2处观察到主峰，但在37℃下储存更长时间后，观察到显着转变为更酸性的同种型。解吸ICE方法是稳定性指示，用于检测异构体分布的变化。

　　图4.已在37℃下储存长达五天的尿素解吸样品的成像毛细管电泳(ICE)电泳图叠加。

　　结论

　　铝吸附疫苗的性质对通常用于治疗性蛋白质稳定性研究的传统生物分析方法的应用提出了挑战。虽然研究表明吸附导致蛋白质抗原的结构和化学修饰，并且吸附可能影响稳定性，但除了推荐之外，几乎没有提供监管指导，包括药物产品放行测试中的特性、纯度和效力。效力方法可能没有必要的准确性和精确度来预测疫苗在整个产品保质期内的有效性和稳定性。取而代之的是，下表1中提出了一组改编自传统治疗性蛋白质分析的测试。尽管从历史上看，抗原表征是在解吸后进行的，但大多数提出的方法都可以直接在FDP上进行。随着基于MS的肽图分析方法(例如MAM)的日益普及，可能不再需要先解吸再使用电泳和色谱方法来确定碎片或化学修饰。