【Protocol】拟南芥核质分离实验

溶液配制：

　　Honda buffer：

　　25 mM Tris-HCl(pH7.4)

　　10 mM MgCl2

　　2.5% (wt/vol) Ficoll 400

　　5% (wt/vol) Dextran T 40

　　0.4 M蔗糖

　　1x Protease Inhibitor Cocktail (用前加)

　　5 mM DTT (用前加)

　　10 mM β-巯基乙醇 (用前加)

　　Triton X-100：20% (vol/vol)

　　试剂及耗材：

　　Triton X-100：#T8787, Sigma, St. Louis, USA

　　蛋白酶抑制剂(cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets): #11836145001, Roche, Mannheim, Germany

　　二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol, DTT): AMRESCO, Solon, USA

　　Ficoll 400: #F4375，Sigma，St. Louis，USA

　　Dextran T40: #17-0270-01, GE Healthcare, Little Chalfont, England

　　UGPase抗体: #AS05086, Agrisera, Vännäs, Sweden

　　Histone H3抗体: #AS10710, Agrisera, Vännäs, Sweden

　　Miracloth滤布: #475855-1R，Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Germany

　　实验流程：

　　1. 称取2 g 10日龄的拟南芥幼苗于液氮中研磨。

　　2. 将样品转移至预冷的离心管中，并加入4 mL Honda buffer，颠倒混匀后置于冰上10 min，使其充分溶解。

　　3. 用Miracloth滤布对样品进行过滤。

　　4. 在滤液中加入终浓度为0.5%的Triton X-100。充分混匀后冰上放置15 min。

　　5. 取出100 μL样品作为总蛋白(Total protein)。

　　6. 4℃，离心1500 g，5 min。转移上清至新管，作为去除了核的细胞质组分蛋白(Nuclei-depleted fraction)。再重复离心2次，去除沉淀。

　　7. 沉淀用1 mL添加了0.1% Triton X-100的Honda buffer进行清洗，洗5次，1500 g，离心5 min。

　　8. 沉淀用Honda buffer重悬，50 g，离心1 min，以去除细胞碎片，细胞壁及淀粉粒等组分。并将上清转移至新的离心管。

　　9. 1800 g，离心5 min，收集的沉淀即为核组分(Nuclei-enriched fraction)。将沉淀溶于100 μL Honda buffer中。

　　10. 将总蛋白、胞质组分和核组分进行SDS-PAGE电泳及Western blot检测分离效果。

　　11. Western blot所用抗体：细胞质组分特异的UGPase抗体(1 : 500稀释)及核组分特异的Histone H3抗体(1 :5000稀释)对同时对各组分进行检测。

　　结果示例：

　　引自ref.3

　　参考文献：

　　1. Kinkema et al., Nuclear Localization of NPR1 Is Required for Activation ofPRGene Expression, The Plant Cell (2020) 12:2339–235

　　2.Xia et al., Developmental and hormonal regulation of the Arabidopsis CER2 gene that codes for a nuclear-localized protein required for the normal accumulation of cuticular caxes, Plant Physiology (1997) 115:925-937

　　3. Long et al., BICELLULAR POLLEN 1 is a modulator of DNA replication and pollen development in Arabidopsis, New Phytologist (2019) 222: 588–603